水相催化酯合成新型酯酶RasEst3的分子克隆、过表达、性质表征与机制解析
导 读
2025年3月，北京工商大学李秀婷教授课题组在国际TOP期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（Q1，IF: 7.7）发表题为“Molecular cloning, overexpression, characterization, and mechanism explanation of an esterase RasEst3 for ester synthesis under aqueous phase”的研究性论文。北京工商大学2022级硕士研究生丁泽为论文第一作者，李秀婷教授为论文通讯作者。该研究得到国家自然科学基金项目（No.32372280, No.31830069）、国家重点研发计划（2022YFD2101401）和北京市教委-市自然基金联合项目（KZ202110011016）的资助。
脂肪酸酯（Fatty acid esters, FAEs）是由醇酸等合成的结构多样且在食品、化妆品、医药、化工能源等工业领域应用均十分广泛的功能性酯类，如作为食品的增稠剂、乳化剂、抗氧化剂，化妆品的皮肤保湿剂和柔软剂、稀释剂，化工行业的涂料、塑料和胶粘剂，以及生物柴油和许多化学品的原料等等。目前工业生产脂肪酸酯主要是通过传统的依赖酸性催化剂与大量有机溶剂的化学合成法，其生产成本高昂且面临资源紧缺与污染治理的双重挑战，亟待寻求环境友好的生物催化途径替代化学合成。然而，目前大多数能够催化脂肪酸酯合成的酶一方面存在溶剂局限，即在非水介质中具有催化酯合成的能力，溶剂中的水会促使酶催化方向转为酯的水解，从而导致酯产率降低；另一方面，部分已报道的水相中具有酯催化能力的酶不仅催化效率低且底物适应性差。为解决酯合成酶资源匮乏，难以满足酯类生产由传统化学合成转型至生物催化的问题，本研究从真菌Rasamsonia emersonii的基因中挖掘并发现了水相中具有极强酯合成能力的新型酯酶RasEst3，为深入探索功能酯的绿色生物合成途径提供新思路。
本研究以课题组前期来源于紫色红曲霉YJX-8的酯合成酶LIP05基因序列为模板，从发酵真菌Rasamsonia emersonii中基因挖掘并实现大肠杆菌异源表达，得到新型酯酶RasEst3，系统分析RasEst3的酶学性质，发现其在pH 3.5和30℃条件下能够在水相中高效催化脂肪酸酯合成，且对中链脂肪酸（如辛酸）表现出显著偏好性。AlphaFold2构建的三维结构模型表明，RasEst3的活性中心包含Ser146-His227-Asp214构成的催化三联体，分子对接实验证实，RasEst3独特的底物口袋小而疏水性强的空间结构特征，是其能够高效地结合中链底物的根本原因。进一步的突变分析与分子动力学模拟表明，Gly69和Thr70形成的氧阴离子洞，以及Tyr112和Tyr145之间的π-π堆积作用，在催化过程中均起到了关键作用。
为进一步优化RasEst3的性能，去除了一段特定的环状区域（Gly177-Ala192）而成功构建了RasEst3-loop突变体，突变体酶的酯合成能力较野生型提升了253.22%，且在高温条件下的热稳定性显著增强。通过分子动力学模拟深入揭示了环状区域对酶活性及热稳定性的双重调控机制：环状区域（Gly177-Ala192）在50℃时仅增强酶的刚性，80℃时则通过稳定活性中心附近区域结构，提升酶的催化能力。本研究发现的新型酯酶及其催化机制的剖析不仅为水相酯合成酶的功能起源提供了重要线索，也为水相酯酶的定向改造、兼具高活性与高稳定性酶的理性设计与工业应用提供理论基础。
研究亮点
1.基因挖掘获得在水相中高效催化酯化反应的新型酯酶RasEst3，其在pH3.5和30℃时活性最高。
2.初步阐明了RasEst3的结构和活性位点的催化机理。
3.从RasEst3中去除特定的环区，显著提高了其酯合成能力和热稳定性。
研究结论
1.基因挖掘获得了能够在水相中高效催化脂肪酸酯合成的新型酯酶RasEst3，最适反应条件为pH 3.5和30℃，该酶具有良好的热稳定性和pH稳定性，对多种金属离子、有机溶剂和表面活性剂均具有较高的耐受性。
2.AlphaFold2预测和分子动力学模拟揭示了RasEst3的三维结构及其催化机制。RasEst3的活性位点包含由Ser146、His227和Asp214组成的催化三联体，其底物通道和结合口袋的空间特征决定了对中链底物的偏好性。研究发现，Gly69和Thr70形成的氧阴离子孔以及Tyr112和Tyr145的π-堆叠作用在催化过程中起关键作用。与LIP05相比，RasEst3的底物通道更狭窄，结合口袋更小，这解释了其对辛酸具有高效催化能力的原因。
3.通过对RasEst3的关键残基进行定点突变，研究了其对催化活性的影响。结果表明，催化三联体（Ser146、His227和Asp214）的突变完全丧失了酯合成能力，而Tyr112和Tyr145的突变破坏了π-堆叠作用，导致酶活性显著降低。此外，Gly69和Thr70的突变影响了氧阴离子洞的形成，从而降低了酶与底物的结合能力，而疏水残基（如Val31和Leu79）的突变增强了底物进入活性中心的效率，从而提高了酶的催化效率。
4.通过移除RasEst3的一个特定环区域（Gly177-Ala192），发现其酯合成能力显著提高，如辛酸乙酯的合成效率提升了253.22%。同时，移除该loop区域后，酶的热稳定性增强，在90℃下处理30分钟后仍保留83.95%的活性。分子动力学模拟表明，该loop区域的切除降低了蛋白结构的灵活性，增强了活性中心附近区域的稳定性，从而促进了底物的结合和催化效率。
原文链接 https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.142190
