引言
胃潰瘍（GU）是一種常見的、多發(fā)的呈現(xiàn)世界性分布的胃腸道疾病。胃潰瘍一般由多種因素共同作用導(dǎo)致，其中包括機(jī)體內(nèi)部因素和外界環(huán)境因素。治療和預(yù)防胃潰瘍最常用的藥物包括H2受體拮抗劑（如西咪替丁、雷尼替?。①|(zhì)子泵抑制劑（如奧美拉唑、蘭索拉唑）、抗酸劑和對胃黏膜提供機(jī)械保護(hù)的細(xì)胞保護(hù)劑。然而，長期使用這些藥物可能會引起嚴(yán)重的副作用。因此，安全有效的，特別是植物中的天然提取物作為替代藥物為胃潰瘍的保護(hù)提供了新思路。
胃潰瘍（GU）是一種常見的、多發(fā)的呈現(xiàn)世界性分布的胃腸道疾病。胃潰瘍一般由多種因素共同作用導(dǎo)致，其中包括機(jī)體內(nèi)部因素和外界環(huán)境因素。治療和預(yù)防胃潰瘍最常用的藥物包括H2受體拮抗劑（如西咪替丁、雷尼替?。①|(zhì)子泵抑制劑（如奧美拉唑、蘭索拉唑）、抗酸劑和對胃黏膜提供機(jī)械保護(hù)的細(xì)胞保護(hù)劑。然而，長期使用這些藥物可能會引起嚴(yán)重的副作用。因此，安全有效的，特別是植物中的天然提取物作為替代藥物為胃潰瘍的保護(hù)提供了新思路。
鐵皮石斛是一種具有豐富藥用價值的中草藥，因其廣泛的藥理和臨床作用，在中國和其他東南亞國家被公認(rèn)為優(yōu)質(zhì)健康食品。鐵皮石斛的傳統(tǒng)藥用部位主要是莖，在加工生產(chǎn)的過程中，大量的鐵皮石斛花和葉未得到有效地利用。鐵皮石斛花中富含多種營養(yǎng)成分及與莖中相似的活性成分，包括氨基酸、多糖、黃酮類化合物及多種揮發(fā)性物質(zhì)等。研究者發(fā)現(xiàn)與鐵皮石斛葉、莖比較，花中的黃酮含量較高。而黃酮類化合物也具有抗氧化、抗衰老、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等的生物活性，且在毒理研究中未表現(xiàn)出明顯不良影響。因此，進(jìn)行鐵皮石斛花資源的開發(fā)利用具有重要意義。
浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院邵平教授等在本文中以乙醇誘導(dǎo)小鼠與GES-1細(xì)胞建立急性胃潰瘍模型，評估了石斛花中提取純化的黃酮組分DOFF對該疾病的保護(hù)作用；分析了石斛花黃酮在胃潰瘍小鼠體內(nèi)引起的因子變化；判斷了石斛花黃酮抑制胃潰瘍發(fā)生的分子機(jī)制。
結(jié)果與討論
DOFF對胃潰瘍的保護(hù)作用胃潰瘍的主要臨床表現(xiàn)為胃壁黏膜出血以及組織損傷，經(jīng)不同藥物處理后的小鼠胃組織形貌如圖2所示。模型組小鼠胃黏膜出血嚴(yán)重，胃細(xì)胞黏連度下降，組織間存在大量炎性細(xì)胞浸潤，均證明存在嚴(yán)重胃潰瘍癥狀；DOFF處理組顯著改善了這種乙醇引起的胃黏膜損傷，減少了黏膜出血點(diǎn)數(shù)量并恢復(fù)胃壁完整性，證明來自鐵皮石斛花的黃酮富集物DOFF具有胃潰瘍抑制效果。而高濃度DOFF與低濃度對比更具優(yōu)勢，說明在該實驗條件下，DOFF的保護(hù)作用呈劑量依賴性。
DOFF通過降低炎癥因子，調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)減少胃潰瘍引起的組織損傷文章通過胃組織中各類細(xì)胞因子的變化，分析判斷DOFF緩解胃潰瘍的作用機(jī)制。氧化自由基對細(xì)胞組織的攻擊是組織損傷的最主要內(nèi)因之一，如圖3所示，檢測了各組小鼠胃組織中NO、MPO、MDA以及SOD濃度，結(jié)果證明乙醇誘導(dǎo)下，小鼠胃組織中MPO酶活性顯著上升，促使其體內(nèi)產(chǎn)生大量氧化自由基，導(dǎo)致NO與MDA濃度的上升以及SOD酶活力下降，這些結(jié)果表明過量的氧化自由基是胃潰瘍的重要誘因，而DOFF在實驗中呈劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)了這種變化；觀察炎癥相關(guān)因子，發(fā)現(xiàn)乙醇同樣引起了促炎因子IL-6, IL-1β以及TNF-α的升高，和黏膜完整維持因子NP-SH下降，結(jié)合前面氧化應(yīng)激反應(yīng)的變化，作者推測乙醇在進(jìn)入體內(nèi)后，通過直接物理作用損傷部分胃細(xì)胞，隨后在免疫系統(tǒng)的響應(yīng)下，胃組織分泌大量促炎因子吸引炎性細(xì)胞積聚，隨后炎性細(xì)胞產(chǎn)生的大量氧化自由基在清除受損細(xì)胞的同時殺傷了正常胃細(xì)胞，進(jìn)一步加劇胃組織損傷，最終誘發(fā)胃潰瘍。
DOFF對乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍的作用機(jī)制ROS的積累可通過線粒體依賴性途徑引起細(xì)胞凋亡。如圖4所示，ROS水平在模型組中顯示增加，DOFF與NAC處理后有效阻斷了ROS的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步評估DOFF是否能減輕乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使用JC-1檢測線粒體膜電位（MMP）的水平。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，在對照細(xì)胞中，MMP的下降率為（5.36 ± 1.41）%，而乙醇處理后，下降率增加至（60.49 ± 2.28）%，DOFF、RAPA和NAC預(yù)處理后均降低（P < 0.001），與體內(nèi)結(jié)果一致。免疫熒光實驗顯示，DOFF和RAPA處理顯著提高了HO-1的表達(dá)水平。
通過在細(xì)胞中形成的GFP-LC3來評估自噬情況。對照組的GFP-LC3融合蛋白有規(guī)律地彌散到整個細(xì)胞質(zhì)中。在乙醇與DOFF共同預(yù)處理后，GFP-LC3在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點(diǎn)（P < 0.001），說明自噬形成。如圖5所示，與單獨(dú)用DOFF處理相比，DOFF聯(lián)合RAPA（自噬激動劑）處理顯著提高了LC3βII/LC3βI和Beclin-1蛋白水平，同時降低了自噬流量標(biāo)志物p62的蛋白水平。3-MA（自噬抑制劑）聯(lián)合DOFF處理顯著提高了p62蛋白水平（P ＜ 0.001）。mTOR是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，其上游調(diào)節(jié)途徑包括PI3K/Akt和AMPK。ULK1作為自噬起始復(fù)合物的關(guān)鍵分子可介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生經(jīng)典自噬反應(yīng)。免疫印跡實驗表明DOFF似乎通過AMPK/mTOR/ULK1和PI3K/AKT自噬信號通路減輕乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍。
結(jié)論
提取自鐵皮石斛花的黃酮組分DOFF中鑒定出28 種組分。結(jié)果表明，DOFF減緩乙醇損傷引發(fā)的胃組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡反應(yīng)，從而減少組織中氧化自由基的濃度，避免了氧化應(yīng)激反應(yīng)對組織細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，從而達(dá)到緩解胃潰瘍的生理作用。此外，在分子機(jī)制中，證明DOFF可以通過AMPK/mTOR和PI3K/Akt自噬途徑對胃潰瘍起到保護(hù)作用。
結(jié)果與討論
DOFF對胃潰瘍的保護(hù)作用胃潰瘍的主要臨床表現(xiàn)為胃壁黏膜出血以及組織損傷，經(jīng)不同藥物處理后的小鼠胃組織形貌如圖2所示。模型組小鼠胃黏膜出血嚴(yán)重，胃細(xì)胞黏連度下降，組織間存在大量炎性細(xì)胞浸潤，均證明存在嚴(yán)重胃潰瘍癥狀；DOFF處理組顯著改善了這種乙醇引起的胃黏膜損傷，減少了黏膜出血點(diǎn)數(shù)量并恢復(fù)胃壁完整性，證明來自鐵皮石斛花的黃酮富集物DOFF具有胃潰瘍抑制效果。而高濃度DOFF與低濃度對比更具優(yōu)勢，說明在該實驗條件下，DOFF的保護(hù)作用呈劑量依賴性。
DOFF通過降低炎癥因子，調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)減少胃潰瘍引起的組織損傷文章通過胃組織中各類細(xì)胞因子的變化，分析判斷DOFF緩解胃潰瘍的作用機(jī)制。氧化自由基對細(xì)胞組織的攻擊是組織損傷的最主要內(nèi)因之一，如圖3所示，檢測了各組小鼠胃組織中NO、MPO、MDA以及SOD濃度，結(jié)果證明乙醇誘導(dǎo)下，小鼠胃組織中MPO酶活性顯著上升，促使其體內(nèi)產(chǎn)生大量氧化自由基，導(dǎo)致NO與MDA濃度的上升以及SOD酶活力下降，這些結(jié)果表明過量的氧化自由基是胃潰瘍的重要誘因，而DOFF在實驗中呈劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)了這種變化；觀察炎癥相關(guān)因子，發(fā)現(xiàn)乙醇同樣引起了促炎因子IL-6, IL-1β以及TNF-α的升高，和黏膜完整維持因子NP-SH下降，結(jié)合前面氧化應(yīng)激反應(yīng)的變化，作者推測乙醇在進(jìn)入體內(nèi)后，通過直接物理作用損傷部分胃細(xì)胞，隨后在免疫系統(tǒng)的響應(yīng)下，胃組織分泌大量促炎因子吸引炎性細(xì)胞積聚，隨后炎性細(xì)胞產(chǎn)生的大量氧化自由基在清除受損細(xì)胞的同時殺傷了正常胃細(xì)胞，進(jìn)一步加劇胃組織損傷，最終誘發(fā)胃潰瘍。
DOFF對乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍的作用機(jī)制ROS的積累可通過線粒體依賴性途徑引起細(xì)胞凋亡。如圖4所示，ROS水平在模型組中顯示增加，DOFF與NAC處理后有效阻斷了ROS的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步評估DOFF是否能減輕乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使用JC-1檢測線粒體膜電位（MMP）的水平。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，在對照細(xì)胞中，MMP的下降率為（5.36 ± 1.41）%，而乙醇處理后，下降率增加至（60.49 ± 2.28）%，DOFF、RAPA和NAC預(yù)處理后均降低（P < 0.001），與體內(nèi)結(jié)果一致。免疫熒光實驗顯示，DOFF和RAPA處理顯著提高了HO-1的表達(dá)水平。
通過在細(xì)胞中形成的GFP-LC3來評估自噬情況。對照組的GFP-LC3融合蛋白有規(guī)律地彌散到整個細(xì)胞質(zhì)中。在乙醇與DOFF共同預(yù)處理后，GFP-LC3在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點(diǎn)（P < 0.001），說明自噬形成。如圖5所示，與單獨(dú)用DOFF處理相比，DOFF聯(lián)合RAPA（自噬激動劑）處理顯著提高了LC3βII/LC3βI和Beclin-1蛋白水平，同時降低了自噬流量標(biāo)志物p62的蛋白水平。3-MA（自噬抑制劑）聯(lián)合DOFF處理顯著提高了p62蛋白水平（P ＜ 0.001）。mTOR是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，其上游調(diào)節(jié)途徑包括PI3K/Akt和AMPK。ULK1作為自噬起始復(fù)合物的關(guān)鍵分子可介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生經(jīng)典自噬反應(yīng)。免疫印跡實驗表明DOFF似乎通過AMPK/mTOR/ULK1和PI3K/AKT自噬信號通路減輕乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍。
結(jié)論
提取自鐵皮石斛花的黃酮組分DOFF中鑒定出28 種組分。結(jié)果表明，DOFF減緩乙醇損傷引發(fā)的胃組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡反應(yīng)，從而減少組織中氧化自由基的濃度，避免了氧化應(yīng)激反應(yīng)對組織細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，從而達(dá)到緩解胃潰瘍的生理作用。此外，在分子機(jī)制中，證明DOFF可以通過AMPK/mTOR和PI3K/Akt自噬途徑對胃潰瘍起到保護(hù)作用。
原文鏈接：https://www.sciopen.com/article/10.26599/FSHW.2023.9250048?sessionid=1208592543
