導(dǎo) 讀
2025年3月，北京工商大學(xué)孫寶國(guó)院士團(tuán)隊(duì)李秀婷教授課題組在國(guó)際Top期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（Q1，IF=5.7）發(fā)表題為“Characterization and Mechanism Study of a Novel Ethanol Acetyltransferase from Hanseniaspora uvarum (EatH) with Good Thermostability, pH Stability, and Broad Alcohol Substrate Specificity”的研究性論文。2023級(jí)博士研究生倪冰倩為論文第一作者，李秀婷教授為論文通訊作者。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32372280和31830069）和北京市教委-市自然基金聯(lián)合項(xiàng)目（KZ202110011016）的資助。
乙酸酯是發(fā)酵、烘焙食品中花果香風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者，更因其良好溶解性、較低毒性及可降解性，成為食品加工、醫(yī)藥與化工領(lǐng)域的重要原材料之一，且全球年需求量持續(xù)增長(zhǎng)。然而，目前依賴高能耗、高污染的化學(xué)合成來(lái)生產(chǎn)乙酸酯的傳統(tǒng)方法，在現(xiàn)今全球碳達(dá)峰碳中和“雙碳”戰(zhàn)略倡導(dǎo)下，亟待低能耗、低污染、高效率的生物合成技術(shù)路徑來(lái)替代。研究表明，盡管乙酸酯的生物合成可由脂肪酶/酯酶等催化醇、酸等底物來(lái)實(shí)現(xiàn)，但絕大多數(shù)脂肪酶/酯酶在催化乙酸酯合成過(guò)程中，需控制反應(yīng)體系保持較低的水含量以防止酯化反應(yīng)由合成轉(zhuǎn)向水解，而添加有機(jī)溶劑等助劑則加劇了環(huán)境壓力。課題組前期從產(chǎn)酯酵母——異常威克漢姆酵母YF1503中發(fā)掘到醇?；D(zhuǎn)移酶Eat276，其能在水相條件下高效催化乙醇與乙酰輔酶A合成乙酸酯，因此，利用Eat在水相條件下催化乙酸酯的生物合成，是取代目前化學(xué)合成法生產(chǎn)乙酸酯的最可行路徑之一。然而，值得注意的是，目前對(duì)于微生物來(lái)源醇?；D(zhuǎn)移酶Eat的相關(guān)研究較為匱乏，Eat催化合成乙酸酯的底物選擇、反應(yīng)特性，尤其是酶分子結(jié)構(gòu)與催化合成乙酸酯的內(nèi)在機(jī)制尚未明晰，阻礙了生物酶法合成乙酸酯類物質(zhì)的技術(shù)應(yīng)用。基于此，本研究以異常威克漢姆酵母YF1503來(lái)源的醇酰基轉(zhuǎn)移酶Eat276為模板，從非釀酒酵母Hanseniaspora uvarum基因組中挖掘得到新型醇?；D(zhuǎn)移酶EatH，首次系統(tǒng)表征其酶學(xué)性質(zhì)，深入探討其催化乙酸酯形成的分子機(jī)制，為拓展Eat家族資源庫(kù)，以及酶的定向改造與設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)于推動(dòng)乙酸酯生產(chǎn)由化學(xué)法合成向“低碳生物合成”升級(jí)具有重要的指導(dǎo)作用與實(shí)際意義。
本研究以課題組前期篩選的來(lái)源于異常威克漢姆酵母YF1503的醇?；D(zhuǎn)移酶Eat276為模板，通過(guò)基因挖掘從非釀酒酵母Hanseniaspora uvarum中鑒定出新型醇?；D(zhuǎn)移酶EatH，經(jīng)異源表達(dá)與純化后系統(tǒng)表征其酶學(xué)性質(zhì)，顯示EatH是目前已知的具有最優(yōu)異熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的醇?；D(zhuǎn)移酶，其對(duì)短鏈醇至芳香醇的醇類底物均展現(xiàn)出催化能力，且對(duì)短鏈?；w具有高選擇性。研究還利用AlphaFold 3、分子動(dòng)力學(xué)模擬等結(jié)合性質(zhì)研究、定點(diǎn)突變等技術(shù)進(jìn)一步揭示了EatH活性位點(diǎn)在底物結(jié)合與催化過(guò)程中的分子機(jī)制。論文首次闡明Hanseniaspora uvarum來(lái)源EatH的催化特性、蛋白結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的分子機(jī)制，填補(bǔ)Eat家族“結(jié)構(gòu)-功能”關(guān)聯(lián)研究的空白，為醇?；D(zhuǎn)移酶的理性設(shè)計(jì)與工業(yè)化應(yīng)用奠定了分子基礎(chǔ)，為乙酸酯的綠色生物合成提供重要數(shù)據(jù)與理論支撐。
乙酸酯是發(fā)酵、烘焙食品中花果香風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者，更因其良好溶解性、較低毒性及可降解性，成為食品加工、醫(yī)藥與化工領(lǐng)域的重要原材料之一，且全球年需求量持續(xù)增長(zhǎng)。然而，目前依賴高能耗、高污染的化學(xué)合成來(lái)生產(chǎn)乙酸酯的傳統(tǒng)方法，在現(xiàn)今全球碳達(dá)峰碳中和“雙碳”戰(zhàn)略倡導(dǎo)下，亟待低能耗、低污染、高效率的生物合成技術(shù)路徑來(lái)替代。研究表明，盡管乙酸酯的生物合成可由脂肪酶/酯酶等催化醇、酸等底物來(lái)實(shí)現(xiàn)，但絕大多數(shù)脂肪酶/酯酶在催化乙酸酯合成過(guò)程中，需控制反應(yīng)體系保持較低的水含量以防止酯化反應(yīng)由合成轉(zhuǎn)向水解，而添加有機(jī)溶劑等助劑則加劇了環(huán)境壓力。課題組前期從產(chǎn)酯酵母——異常威克漢姆酵母YF1503中發(fā)掘到醇?；D(zhuǎn)移酶Eat276，其能在水相條件下高效催化乙醇與乙酰輔酶A合成乙酸酯，因此，利用Eat在水相條件下催化乙酸酯的生物合成，是取代目前化學(xué)合成法生產(chǎn)乙酸酯的最可行路徑之一。然而，值得注意的是，目前對(duì)于微生物來(lái)源醇?；D(zhuǎn)移酶Eat的相關(guān)研究較為匱乏，Eat催化合成乙酸酯的底物選擇、反應(yīng)特性，尤其是酶分子結(jié)構(gòu)與催化合成乙酸酯的內(nèi)在機(jī)制尚未明晰，阻礙了生物酶法合成乙酸酯類物質(zhì)的技術(shù)應(yīng)用。基于此，本研究以異常威克漢姆酵母YF1503來(lái)源的醇酰基轉(zhuǎn)移酶Eat276為模板，從非釀酒酵母Hanseniaspora uvarum基因組中挖掘得到新型醇?；D(zhuǎn)移酶EatH，首次系統(tǒng)表征其酶學(xué)性質(zhì)，深入探討其催化乙酸酯形成的分子機(jī)制，為拓展Eat家族資源庫(kù)，以及酶的定向改造與設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)于推動(dòng)乙酸酯生產(chǎn)由化學(xué)法合成向“低碳生物合成”升級(jí)具有重要的指導(dǎo)作用與實(shí)際意義。
本研究以課題組前期篩選的來(lái)源于異常威克漢姆酵母YF1503的醇?；D(zhuǎn)移酶Eat276為模板，通過(guò)基因挖掘從非釀酒酵母Hanseniaspora uvarum中鑒定出新型醇?；D(zhuǎn)移酶EatH，經(jīng)異源表達(dá)與純化后系統(tǒng)表征其酶學(xué)性質(zhì)，顯示EatH是目前已知的具有最優(yōu)異熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的醇?；D(zhuǎn)移酶，其對(duì)短鏈醇至芳香醇的醇類底物均展現(xiàn)出催化能力，且對(duì)短鏈?；w具有高選擇性。研究還利用AlphaFold 3、分子動(dòng)力學(xué)模擬等結(jié)合性質(zhì)研究、定點(diǎn)突變等技術(shù)進(jìn)一步揭示了EatH活性位點(diǎn)在底物結(jié)合與催化過(guò)程中的分子機(jī)制。論文首次闡明Hanseniaspora uvarum來(lái)源EatH的催化特性、蛋白結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的分子機(jī)制，填補(bǔ)Eat家族“結(jié)構(gòu)-功能”關(guān)聯(lián)研究的空白，為醇?；D(zhuǎn)移酶的理性設(shè)計(jì)與工業(yè)化應(yīng)用奠定了分子基礎(chǔ)，為乙酸酯的綠色生物合成提供重要數(shù)據(jù)與理論支撐。
研究亮點(diǎn)
基因挖掘獲得新型醇?；D(zhuǎn)移酶EatH。
EatH在25-35°C的溫度條件下孵育24小時(shí)仍可保持穩(wěn)定。
初步闡明了EatH的結(jié)構(gòu)與活性位點(diǎn)的關(guān)系，N149位點(diǎn)可作為醇酰基轉(zhuǎn)移酶Eat底物特異性改造的有效靶點(diǎn)。
基因挖掘獲得新型醇?；D(zhuǎn)移酶EatH。
EatH在25-35°C的溫度條件下孵育24小時(shí)仍可保持穩(wěn)定。
初步闡明了EatH的結(jié)構(gòu)與活性位點(diǎn)的關(guān)系，N149位點(diǎn)可作為醇酰基轉(zhuǎn)移酶Eat底物特異性改造的有效靶點(diǎn)。
研究結(jié)果
?通過(guò)基因挖掘獲得了一個(gè)新型醇酰基轉(zhuǎn)移酶EatH，最適反應(yīng)條件為pH 7.5和35°C，該酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，對(duì)多種金屬離子、有機(jī)溶劑和表面活性劑均具有較高的耐受性。
?EatH偏愛(ài)短鏈?；w，而具有廣泛的醇類物質(zhì)底物譜，對(duì)短鏈醇至芳香醇的醇類底物均展現(xiàn)出催化能力。
?利用AlphaFold 3對(duì)EatH結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，EatH具有典型的α/β折疊水解酶的特征，整體結(jié)構(gòu)由一個(gè)核心催化域和一個(gè)蓋子結(jié)構(gòu)域組成，其催化三聯(lián)體為Ser124-His296-Asp148，氧陰離子洞為L(zhǎng)eu58和Leu125。
?分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬以及定點(diǎn)突變技術(shù)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了EatH對(duì)催化和底物結(jié)合過(guò)程至關(guān)重要的氨基酸位點(diǎn)。Tyr123和Phe297之間形成的Π-Π堆積的相互作用對(duì)活性中心的穩(wěn)定至關(guān)重要，Tyr204的空間位阻對(duì)酶的底物特異性具有重要影響，Asn149位點(diǎn)和Gln154位點(diǎn)對(duì)于蛋白質(zhì)構(gòu)象靈活性具有重要作用。
?通過(guò)基因挖掘獲得了一個(gè)新型醇酰基轉(zhuǎn)移酶EatH，最適反應(yīng)條件為pH 7.5和35°C，該酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，對(duì)多種金屬離子、有機(jī)溶劑和表面活性劑均具有較高的耐受性。
?EatH偏愛(ài)短鏈?；w，而具有廣泛的醇類物質(zhì)底物譜，對(duì)短鏈醇至芳香醇的醇類底物均展現(xiàn)出催化能力。
?利用AlphaFold 3對(duì)EatH結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，EatH具有典型的α/β折疊水解酶的特征，整體結(jié)構(gòu)由一個(gè)核心催化域和一個(gè)蓋子結(jié)構(gòu)域組成，其催化三聯(lián)體為Ser124-His296-Asp148，氧陰離子洞為L(zhǎng)eu58和Leu125。
?分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬以及定點(diǎn)突變技術(shù)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了EatH對(duì)催化和底物結(jié)合過(guò)程至關(guān)重要的氨基酸位點(diǎn)。Tyr123和Phe297之間形成的Π-Π堆積的相互作用對(duì)活性中心的穩(wěn)定至關(guān)重要，Tyr204的空間位阻對(duì)酶的底物特異性具有重要影響，Asn149位點(diǎn)和Gln154位點(diǎn)對(duì)于蛋白質(zhì)構(gòu)象靈活性具有重要作用。
原文鏈接https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c12376
